摘要
    支原体是介于细菌和病毒之间的一类微生物，它所引起的肺炎、泌尿生殖道及关节等感染得到广泛的重视。解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum,Uu）是较小的支原体，在一定的条件下可引起非淋球菌性尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、子宫内膜炎、宫内胎儿生长发育迟缓、宫内死胎、低体重儿、新生儿脑膜炎及肺炎、不育、肝周围炎及肾盂肾炎等多种疾病。[1]Uu感染常用四环素、大环内酯类等抗箘素治疗。近年来临床统计发现Uu的治疗难度增加，其感染呈上升趋势。追究原因在于临床不规范的应用抗生素造成反复感染及慢性迁延，使耐药菌株不断增加。[2]并且临床缺乏专性抗支原体药物。因此，目前开发专门针对Uu或支原体的新药已成为研究热点。[2，3]
柴胡（Bupleurum）为一种常用中药，在祖国医学中应用已有2000多年的历史。柴胡是伞形科植物北柴胡或狭叶柴胡等的根或全草，性味苦、平，有解表，退热，疏肝解郁，升举阳气的功效。［4,5］柴胡的化学成分相当复杂，迄今为止已报道含有皂苷、木脂素、黄酮、挥发油、甾醇、香豆素、有机酸、多糖及多炔类成分等。柴胡皂苷的研究在1916年就开始有报道，在1930年被分离纯化。上世纪六十年代以后对柴胡皂苷的研究有了较大的飞跃。[5]
      柴胡中的柴胡皂苷（Saikosaponin）有很强的抗微生物活性，据研究能抑制多种DNA和RNA病毒，体外能不可逆地灭活单纯疱疹病毒。[3,6]柴胡皂苷D体外使麻疹病毒、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒失去活性的浓度分别为5umol/L、5umol/L、0.1umol/L。[6]但是具体抗微生物的机制仍不是很明确。
    近来，我们实验室研究发现柴胡皂苷D对Uu菌株有很强的抑制作用。我们用三种不同来源柴胡皂苷D（中国药品生物制品检定所、上海医药工业研究院、复旦大学药学院）分别对血清8型(ATCC27618) Uu标准株和血清3型(ATCC27815)Up标准株,和52株Uu临床分离株进行了测试,证实柴胡皂苷D体外最小抑菌浓度（MIC）为4－16ug/ml，最小杀菌浓度(MBC)为16ug/ml, MIC50为8ug/ml,MIC90为16ug/ml.这在一般的中草药中是极少见的。具有进一步研究的必要。

第一部分：建立小鼠生殖道感染模型。
    该部分对小鼠接种血清8型(ATCC27618) Uu标准株和血清3型(ATCC27815)Up标准株的感染后临床表现，感染率，感染持续时间等问题进行研究，期待建立良好的小鼠生殖道感染模型。昆明小鼠购于交通大学医学院实验动物中心，并由同济大学实验动物中心饲养。小鼠适应环境后，每只颈皮下注射苯甲酸雌二醇0.4mg (0.2ml),每周一次.血清8、3型Uu标准株复苏：标准株接种于脲脲原体液体培养基，放入37℃培养箱内复苏，传代，在第四代时对培养液进行颜色变化单位（CCU）计数，为1×105CCU/ml,备用。小鼠激素给药一周后，将菌液（1×105CCU/ml）50μl用Eppendorf管伸入小鼠阴道约0.5cm，直接注入。小鼠接种1周后检测。用2支无菌签棒伸入小鼠阴道0.5cm转动5周后将第一支棉签在液体培养基中充分洗脱，37℃培养箱内培养，24小时后观察阳性结果。统计阳性率。观察小鼠感染后小鼠感染后对进食量、体重、毛发、活动情况、外生殖道情况等每周进行观察并记录。监测小鼠60天，90天，120天阳性率及带菌量。感染后10天，检测小鼠各器官（阴道、卵巢、肾、肝、脾、肺）Uu阳性率，小鼠阴道上皮及输卵管病理检测。结果显示血清8型Uu感染动物模型适用于药物测试。

第二部分：强力霉素和红霉素的实验治疗
    按照美国CDC性传播疾病治疗指南（2007）红霉素和强力霉素清除Uu感染给药剂量分别为为20mg/kg和2mg/kg，在小鼠（10只）感染后一周后开始颈皮下注射给药，感染对照组给予生理盐水皮下注射。每天2次，疗程7天。疗程结束3天后检测小鼠生殖道阳性率及带菌量。结果显示小鼠生殖道感染模型适用于药物测试，单一疗程的红霉素或强力霉素很难清除血清8型Uu感染。

第三部分：柴胡皂甙D实验治疗
    设立高、低二个剂量组每组10只，另外设立体外治疗组，红霉素组和对照组。在小鼠感染后一周后开始颈皮下注射给药，每天2次，疗程7天。全程观察小鼠临床表现，进食量、体重、毛发、活动情况、外生殖道情况等每天进行观察并记录。疗程结束3天后检测各组小鼠生殖道阳性率及带菌量。各组随机取4只小鼠阴道上皮及输卵管病理检测。结果显示柴胡皂甙在小鼠体内有一定的抗Uu活性，其效果与红霉素相当。

关键词：解脲脲原体，微小脲原体，动物模型，最低抑菌浓度，柴胡皂苷d 

 
目录
摘要 I
ABSTRACT III
目录 V
符号说明 VII
第1章 引言 1
1.1 概述 1
1.2 支原体感染治疗新进展 2
1.2.1 西药方面的进展 2
1.2.2 中草药方面的进展 2
1.2.3 增强剂的研究 3
1.3 柴胡抗菌成分研究现状 3
1.4柴胡皂苷的结构及活性研究 4
第2章 人型支原体的生长规律研究 5
2.1 概述 5
2.2 材料和方法 5
2.2.1材料 5
2.2.2 试验所需耗材和器材 5
2.2.3 方法 6
2.3 结果 7
2.3.1 Mh的生长曲线（图1）。 7
2.3.2 菌落形态的演变 7
2.3.3 液体培养基的颜色变化 8
2.4 讨论 9
2.5 小结 10
第3章 支原体培养基中抗真菌抑菌剂的筛选 11
3.1 概述 11
3.2 材料与方法 11
3.2.1  材料 11
3.2.2 方法 12
3.3 结果 12
3.3.1 抑菌剂的选择 12
3.3.2 抑菌剂浓度的确定 13
3.3 讨论 14
3.4 小结 15
第4章 柴胡皂苷单体D对支原体的体外作用研究 16
4．1 概述 16
4．2 材料与方法 16
4.2.1 材料 16
4.2.2 方法 16
4.3 结果 18
4.3.1 对临床分离到的Uu及Mh的结果 18
4.3.2 对三种标准株的结果 18
4.4 讨论 18
4.5 结论 21
第5章 结论与展望 22
致谢 23
参考文献 24
在读期间发表的学术论文 27
 
第1章 引言
1.1 概述
    支原体是一种介于细菌和病毒之间的微生物。它的首次发现是在1898年，法国的Nocard及Roux用含动物血清的人工培养基自患牛肺疫的病灶中分离出此种微生物，当时命名为胸膜肺炎微生物（pleuropneumonia organism,PPO）,40年来一直以为它仅是动物的寄生菌或致病菌。至1937年Dienes自妇女下生殖道巴氏腺炎的脓汁中分离出第一株人系支原体，使人们认识到，支原体对人类也有危害。目前从人体分离出16种支原体，其中，5种对人有致病性，即解脲脲原体（Uu）、微小脲原体（Up）、人型支原体（Mh）、肺炎支原体（M.pneumoniae）、生殖支原体（M.genitalium）、发酵支原体（M.fermentans）。解脲脲原体、微小脲原体可引起非淋球菌性尿道炎（NGU）、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、早产、低体重新生儿及新生儿肺炎、脑膜炎、败血症。人型支原体可引起盆腔感染、产后热、肾盂肾炎及新生儿脑膜炎、脑脓肿等[1]。