目录
摘 要 I
ABSTRACT ΙV
引言 1
材料与方法  12
1. 实验材料 12
2. 实验方法 19
结果与讨论 33
第一章 hPFTAIRE1与14-3-3家族蛋白的相互作用及功能研究 33
第二章 hPFTAIRE1与PLZF蛋白的相互作用及功能研究  48
第三章 hPFTAIRE1与KIAA0202蛋白的相互作用及功能研究 57
第四章 CyclinY基因的鉴定及分析 65
第五章 应用酵母双杂交系统筛选CyclinY相互作用蛋白 77
参考文献  90 
总结 101
在学期间发表论文 102
致谢 103
 
摘要
    我们利用简并PCR得到的EST片段作为探针筛选Hela细胞cDNA文库，得到一个编码Cdc2相关蛋白激酶的基因hPFTAIRE1。hPFTAIRE1基因编码区全长1410 bp，编码一个469 aa的蛋白，此蛋白的氨基酸序列与小鼠PFTAIRE1蛋白的氨基酸序列同源性为95%。hPFTAIRE1的第140到440个氨基酸存在一个激酶催化结构域，该结构域与Cdc2中的对应结构域有53%的同源性，包括了ATP结合位点以及Ser/Thr蛋白激酶活性位点； hPFTAIRE1 N端140aa及C端约30aa都是此蛋白所特有的，与其它激酶没有任何同源性。序列特征分析发现在hPFTAIRE1蛋白的N端含两个推测的核定位信号，但是亚细胞定位实验表明在Hela细胞中GFP-hPFTAIRE1融合蛋白主要分布在胞浆中。hPFTAIRE1基因在人脑，睾丸，卵巢，心脏，肾脏以及胰腺中大量表达。为了研究受hPFTAIRE1调控的蛋白及其作用底物，我们选用人脑LexA酵母双杂交系统，以全长hPFTAIRE1作为诱饵，筛选与hPFTAIRE1的相互作用蛋白。我们筛选得到7个能与hPFTAIRE1相互作用的蛋白，它们分别是14-3-3，14-3-3，14-3-3，14-3-3，KIAA0202，PLZF和Cyclin Y。
    14-3-3家族蛋白是一类氨基酸序列高度保守的蛋白，普遍存在于动物、植物和真菌中。其家族成员在脑神经以及中枢神经细胞中也大量表达。我们用免疫共沉淀实验证明hPFTAIRE1蛋白与此家族成员中的四个蛋白之间存在相互作用。序列分析表明hPFTAIRE1氨基酸序列中含有一个14-3-3蛋白识别序列。我们的实验证明该识别序列是hPFTAIRE1与14-3-3蛋白相互作用所必需的，缺失此识别序列的hPFTAIRE1突变体（hPFTAIRE1Δ）无法与14-3-3蛋白相互作用。14-3-3识别序列中Ser的磷酸化与否有时会影响其结合能力，为了深入分析hPFTAIRE1与14-3-3蛋白的相互作用，我们将hPFTAIRE1蛋白119位的Ser和120位的Ser分别突变成Ala（S119A hPFTAIRE1，S120A hPFTAIRE1）。酵母双杂交系统及体内体外实验证明，当hPFTAIRE1蛋白119位的Ser被替换成Ala以后，hPFTAIRE1与14-3-3蛋白之间的相互作用完全被阻断；但是120位的Ser被替换以后，hPFTAIRE1仍然可以与14-3-3蛋白相互作用，尽管相互作用的强度有所减弱。由此可见hPFTAIRE1蛋白119位的Ser在与14-3-3蛋白的结合中起关键作用。由于hPFTAIRE1的14-3-3蛋白识别序列与其N端的一个核定位信号有所重叠，因此我们分析hPFTAIRE1的亚细胞定位是否受14-3-3蛋白结合的调控。结果表明突变前后的hPFTAIRE1蛋白亚细胞定位并无变化，与野生型hPFTAIRE1一样，GFP融合的三种hPFTAIRE1突变体在Hela和SH-SY5Y中都是分布在细胞浆中，说明14-3-3蛋白的结合与否并不影响hPFTAIRE1蛋白在细胞内的定位。
    PLZF是我们利用酵母双杂交系统筛选到的另一个可以与hPFTAIRE1结合的蛋白，-半乳糖苷酶活力检测以及SD Gal His- Trp- Leu-平板生长实验都证明了hPFTAIRE1与PLZF之间存在相互作用。PLZF蛋白属于POZ/BTB和Krüppel 锌指转录因子家族。位于蛋白N端的POZ/BTB结构域在PLZF与其他蛋白的相互结合中发挥重要作用。我们构建了三种PLZF突变体，分别缺失了POZ/BTB结构域，N端结构域以及C端的 Krüppel锌指结构域。研究结果表明Krüppel锌指结构域在hPFTAIRE1与PLZF的相互结合中发挥主要作用。我们还检测了PLZF与另外一个Cdc2相关蛋白激酶PCTAIRE1之间的相互作用，-半乳糖苷酶活力检测以及免疫共沉淀实验证明，与hPFTAIRE1一样，PCTAIRE1也能与PLZF相互作用。PLZF在细胞生长中担任多重角色，而且其转录因子的活性受到磷酸化的调节；我们的研究结果表明hPFTAIRE1和PCTAIRE1有可能在PLZF功能调控方面发挥作用。
    在双杂交过程中我们还筛选到一个目前尚未报道的基因CyclinY。CyclinY基因编码区全长1026 bp，编码一个341 aa的蛋白。从序列上推导CyclinY的143-249 aa之间含有一个Cyclin box结构域。序列分析表明，与其他Cyclin家族成员一样，在CyclinY的高级结构中也存在着保守的五螺旋束状核心结构域。进化树分析表明，CyclinY在序列上与p35 (Cdk5的Cyclin) 蛋白最接近。BLAST表明CyclinY基因定位在染色体10p11.22上。Northern杂交能检测到三个转录本分别为4.2 kb、4.0 kb和2.0 kb。其中4.2 kb和4.0 kb转录本在人的各种组织中呈组成性表达，而且表达量较低，然而2.0 kb转录本则有所不同，它在不同组织中的表达量差异很大，在睾丸，心脏和骨骼肌中大量表达，而在其他组织中却表达量很低。CyclinY蛋白与GFP蛋白融合表达于Hela细胞，结果表明该融合蛋白分布在Hela细胞的整个细胞中。为了研究CyclinY的结合蛋白，我们以CyclinY为诱饵筛选人脑LexA酵母双杂交文库，除了hPFTAIRE1以外，我们还筛选得到一个与CyclinY相互作用的蛋白：PCTAIRE1。这些结果表明CyclinY可能与多种蛋白激酶相互作用，从而参与多种生命调控过程。